賽默飛Veriti96梯度PCR儀做實(shí)驗(yàn)時(shí)的影響因素有？

　　賽默飛Veriti96梯度PCR儀采用了成熟的帕爾貼技術(shù)準(zhǔn)確控制升降溫度，多重溫度探針檢測(cè)系統(tǒng)，確保每臺(tái)儀器穩(wěn)定可靠運(yùn)行。每一個(gè)加熱孔都經(jīng)過(guò)準(zhǔn)確計(jì)算，升溫更快，溫控更準(zhǔn)確，保證實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定進(jìn)行。

　　本產(chǎn)品能夠滿足實(shí)驗(yàn)室的需求和研究者的實(shí)驗(yàn)要求，出色地完成普通PCR、梯度PCR、長(zhǎng)片段擴(kuò)增、恒溫酶切和連接等實(shí)驗(yàn)等試驗(yàn)；同時(shí)它還采用簡(jiǎn)單的操作面板，很好的精度和穩(wěn)定性保障結(jié)果再現(xiàn)，升降溫速率快，Z高可達(dá)3度/秒，12步梯度選擇。

　　使用賽默飛Veriti96梯度PCR儀做實(shí)驗(yàn)時(shí)有哪些影響因素？

　　1、酶及其濃度

　　目前有兩種TaqDNA聚合酶供應(yīng)，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U（指總反應(yīng)體積為100ul時(shí)），濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量減少。

　　2、dNTP的質(zhì)量與濃度

　　dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1MNaOH或1MTris.HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會(huì)使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低)，就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過(guò)低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。

　　3、溫度與時(shí)間的設(shè)置

　　基于賽默飛Veriti96梯度PCR儀原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90~95℃變性，再迅速冷卻至40~60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70~75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對(duì)于較短靶基因（長(zhǎng)度為100~300bp時(shí)）可采用二溫度點(diǎn)法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸（此溫度TaqDNA酶仍有較高的催化活性）。